L'anemia emolitica immuno-mediata è una patologia ematologica comune nel cane e nel gatto: il clinico deve essere molto confidente nella diagnosi, in quanto si tratta di una patologia con elevata mortalità che necessità di terapie immuno-soppressive prolungate. 

Basandoci anche sulle recenti linee guida pubblicate dall'ACVIM (vedi nostro precedente blog: https://www.mylavblog.net/ematologia/254-254.html) cerchiamo di indicare quali sono gli step fondamentali per una diagnosi accurata.

Aspetti clinico-patologici generali - Le classiche forme acute e rigenerative sono caratterizzate da rapido sviluppo di anemia rigenerativa, spesso macrocitica/ipocromica con iperbilirubinemia (che tuttavia è proporzionale al grado di distruzione eritrocitaria, e quindi può anche essere non presente nelle forme più blande o croniche).

Le forme croniche e a lenta evoluzione hanno un basso tasso di distruzione eritrocitaria o sono dirette prevalentemente contro i precursori eritrocitari midollari. Queste forme sono quindi spesso non rigenerative, sono diagnosticate mediante esclusione di altre patologie in grado di causare anemia cronica, possono avere specifiche anomalie midollari e variabile positività ai test in grado di rilevare gli anticorpi anti-eritrocitari.

Figura 1. Esame citologico midollare con segni di distruzione immuno-mediata dei precursori eritroidi (Precursor-Targeted Immune Mediated Anemia): un macrofago ha fagocitato e distruggerà due precursori della linea eritroide.

Alterazioni eritrocitarie - Nelle classiche forme acute/rigenerative, la valutazione dello striscio ematico è molto importante in quanto permette di solito di rilevare vari gradi di anisocitosi, policromasia, sferocitosi ed eventuale presenza di "ghost-cells". Nelle forme croniche non rigenerative invece lo striscio ematico non mostra di solito rilievi significativi.

Figura 2. Marcata anisocitosi, policromasia, normoblastemia e sferocitosi in uno striscio ematico di cane con AEIM. In basso a sinistra è inoltre presente una "ghost cell", ovvero un eritrocita svuotato del suo contenuto in emoglobina.

Agglutinazione degli eritrociti - Molte AEIM sono caratterizzate da auto-agglutinazione spontanea, che però non è sempre presente.

Se si osserva auto-agglutinazione del sangue intero in provetta o su vetrino, è consigliabile eseguire un'ulteriore stima diluendo il sangue con quantità crescenti di fisiologica (1 goccia di sangue + 1 goccia di fisiologica; 1 goccia di sangue + 2 gocce di fisiologica; 1 goccia di sangue + 4 gocce di fisiologica; ecc.).

Se il sangue persiste ad agglutinare anche con diluizioni crescenti, l'ipotesi di una eziogenesi immuno-mediata è fortemente supportata. Il processo di diluizione serve per ridurre i falsi positivi (pseudo-agglutinazione e formazione di rouleaux), che potrebbero dipendere da uno stato infiammatorio aspecifico o da un aumento della concentrazione proteica plasmatica.

Figura 3. Presenza di auto-agglutinazione del sangue su vetrino. Se questo fenomeno è persistente anche dopo progressiva diluizione con fisiologica, è considerato supportivo di una eziogenesi immuno-mediata.

Dimostrazione della presenza di immuno-globuline (IgG/IgM) e/o complemento adesi agli eritrociti -  Questi test hanno lo scopo di identificare sulla superficie degli eritrociti, le agglutinine adese sulla membrana, responsabili della risposta auto-immune.

A questo scopo esistono due metodi principali: il test di Coombs (Direct Antiglobulin Test - DAT) e la citofluorimetria.

Il test di Coombs prende il nome dal suo inventore, un ematologo umano, che dimostrò la possibilità di indurre una agglutinazione di eritrociti con aggiunta di antisieri specifici (contenenti immuno-globuline anti-anticorpi della specie di interesse).

Gli eritrociti del paziente vengono prima lavati per eliminare le proteine aspecifiche adese sulla loro superficie: in questo modo solo le eventuali immuno-globuline o il complemento auto-reattivi rimarrebbero adesi alla superficie del globulo rosso. Aggiungendo il reattivo contenente immuno-globuline in grado di aderire agli anticorpi canini o felini, gli eritrociti positivi tendono ad agglutinarsi determinando la reazione positiva.

Ci sono diversi metodi per effettuare il test di Coombs ma attualmente, il più affidabile è quello su colonna di gel che abbiamo adottato nel nostro laboratorio.

Figura 4. Esempi di test di Coombs positivi con differenti pattern di positività (4+, 3+ e 2+ rispettivamente da sinistra a destra) e relativo controllo negativo (gel a destra).

Il test di Coombs è considerato un test molto specifico per AEIM, anche se non sensibile al 100%. Per ovviare a questo problema, è consigliabile accoppiarlo all'indagine citofluorimetrica, che invece è meno specifica, ma più sensibile.

Possibili falsi positivi si possono infatti avere in corso di processi infiammatori di varia origine. Con la citofluorimetria è possibile identificare la presenza di auto-anticorpi sulla superficie degli eritrociti, usando anticorpi anti-immuno-globuline canine o feline marcati con una sostanza fluorescente, secondo lo schema della figura seguente.

Figura 5. Esempio schematico del funzionamento della citofluorimetria per l'identificazione di immuno-globuline anti-RBC. Gli eritrociti vengono incubati con anticorpi marcati con sostanza fluorescente, in grado di aderire agli anticorpi felini o canini. In caso di adesione, gli RBC positivi vengono riconosciuti dal citofluorimetro.

Sia il test di Coombs che la citofluorimetria possono stimare la quantità di RBC positivi per la presenza di auto-anticorpi: il primo viene quindi gradato secondo una scala visiva che va da 1+ a 4+, la seconda secondo la percentuale di positività degli RBC con fluorescenza positiva.

Attualmente il laboratorio Mylav consente di effettuare i due test specifici per l'AEIM singolarmente o in un profilo completo e ad un costo conveniente.

I risultati dei due test possono quindi essere interpretati ed integrati secondo l'algoritmo seguente:

Walter Bertazzolo, Med. Vet. EBVS European Specialist in Veterinary Clinical Pathology (Dipl. ECVCP); Direttore Scientifico di MYLAV