Che fare se un test antigenico sierologico per FeLV risulta positivo ma la biologia molecolare è negativa? Come si giustifica tale situazione? Ecco alcune possibili spiegazioni derivate da due recenti studi.

Il virus della leucemia felina (Feline Leukemia Virus, FeLV) è un retrovirus che infetta i gatti in tutto il mondo. L'infezione può causare una vasta gamma di segni clinici dipendenti dal ceppo virale e dalla risposta immunitaria dell'ospite.

Le malattie associate alla FeLV includono neoplasie ematopoietiche, malattie immunomediate e degenerative, nonché immunodepressione.

La sopravvivenza mediana dei gatti con infezione progressiva (chiamata anche viremia persistente) è di circa 2-3 anni dalla diagnosi. Di conseguenza, è importante conoscere l'accuratezza dei test diagnostici per poterli interpretare in modo corretto.

Sono disponibili diversi test diagnostici per la FeLV, tra cui test immuno-cromatografici a flusso laterale (Lateral Flow Test, LFI) o ELISA per l'antigene p27, PCR per il DNA provirale, test anticorpali mediante immunofluorescenza e PCR a trascrizione inversa per l'RNA virale e isolamento virale.

La diffusione dell'infezione da FeLV è diminuita in alcune regioni del Nord America e dell'Europa grazie all’ampia diffusione dei test diagnostici, l’uso dei vaccini e l'isolamento dei gatti positivi. Tuttavia, la forma regressiva della malattia, in cui il virus rimane incluso nel DNA delle cellule ospite in forma di “provirus”, è difficile da individuare e quindi sottostimata.

È fondamentale distinguere tra i risultati veri e falsi-positivi ai test antigenici/sierologici, poiché molti gatti vengono sottoposti a eutanasia soltanto sulla base di un risultato positivo dei test LFI/ELISA per la FeLV.

Due studi recenti hanno messo in evidenza che nei gatti con malattie ematologiche i test diagnostici per la FeLV possono fornire dei risultati discordanti tra loro. In particolare, il primo studio riguardava 21 gatti con malattie ematologiche che mostravano risultati positivi al test sierologico antigenico LFI/ELISA per p27, ma la PCR per il DNA provirale risultava negativa.

Il secondo studio, invece, valutava 18 gatti con sospetta anemia emolitica immunomediata (Immune-Mediated Hemolytic Anemia, IMHA) in cui era stata riscontrata una discrepanza nei risultati dei test diagnostici per la FeLV: positività al test antigenico FeLV ed esito negativo alla PCR per il provirus FeLV.

Entrambi gli studi avevano l'obiettivo di descrivere i reperti clinici, diagnostici, terapeutici, e prognostici dei pazienti coinvolti, oltre a indagare quale fosse il metodo diagnostico più efficace per chiarire se presente o meno l’infezione da FeLV in questi casi particolari.

STUDIO 1 (Kornya et al, 2023)

In questo primo studio, sono state analizzate le cartelle cliniche dei gatti risultati positivi alla FeLV tramite LFI o ELISA tra il 2016 e il 2022 presso due strutture veterinarie. I casi venivano inclusi se, in seguito alla positività FeLV tramite LFI o ELISA, erano stati sottoposti alla ricerca del DNA provirale FeLV tramite PCR, su campioni di sangue intero in EDTA o aspirati di midollo osseo.

I dati raccolti per ciascun gatto includevano età, sintomi, risultati dei test per la FeLV, diagnosi, trattamento e outcome. Durante lo studio, 1692 gatti sono stati testati per la FeLV tramite LFI/ELISA, con 73 casi positivi (4,3%). Tra questi gatti, 41 erano maschi e 32 femmine, con un'età mediana di 3,1 anni (range: 9 mesi – 11 anni). Due gatti positivi per FeLV risultavano essere positivi anche per il virus dell’immunodeficienza felina (Feline Immunodeficiency Virus, FIV). In 7 gatti sono stati ripetuti i test diagnostici per la FeLV durante il follow-up, dopo una mediana di 2 mesi dal test iniziale.

Ventuno dei 73 (28.8%) dei gatti risultati positivi ai test FeLV LFI/ELISA presentava risultati negativi alla PCR provirus FeLV. Il valore predittivo positivo dei test antigenici è stato del 71,2%. La prevalenza della FeLV variava dal 2,1% (struttura veterinaria per cure primarie) al 9,1% (ospedale di riferimento). Tra i gatti con risultati discordanti ai test, la maggior parte erano sterilizzati o castrati, con un'età mediana di 2,6 anni.

In 18 dei 21 gatti con risultati discordanti ai test FeLV è stata diagnosticata una malattia ematologica immunomediata (12 anemia, 5 bicitopenia, 1 pancitopenia), un gatto aveva una diagnosi di leucemia linfocitica acuta e due casi avevano una diagnosi di malattia infettiva (Infezione da micoplasmi ematotropi e piotorace). Di questi 21 gatti, 3 (14,3%) sono stati sottoposti a eutanasia durante il ricovero, due per motivi finanziari e uno a causa della prognosi sfavorevole della leucemia linfocitica acuta.

In totale, 18 (85,7%) gatti sono stati dimessi dall'ospedale, di cui 16 (88,9%) sono sopravvissuti da 4 mesi a 6 anni, mentre in due (9,5%) gatti è stato perso il follow-up. Quattro di questi 16 gatti avevano interrotto la terapia farmacologica, ma 12 (75%) casi continuavano ad assumere una terapia immunosoppressiva. Tutti i gatti sono risultati negativi alla ripetizione dei test antigenici durante il follow-up.

STUDIO 2 (Robert et al, 2023)

In questo studio sono stati analizzati i dati clinici e clinico-patologici dei gatti affetti da IMHA in varie strutture veterinarie di Spagna, Italia e Regno Unito tra il 2018 e il 2022.

I casi sono stati reclutati valutando, in modo retrospettivo, i database delle strutture veterinarie. I criteri di inclusione comprendevano diagnosi di IMHA, risultati positivi al test antigenico FeLV e risultati negativi alla PCR provirale FeLV, eseguita su sangue intero. I pazienti sono stati esclusi se non soddisfacevano i criteri di distruzione immunomediata dei globuli rossi o se avevano risultati positivi alla PCR provirus.

In questo studio, 18 gatti soddisfacevano i criteri d’inclusione. Di questi, 8 erano maschi castrati e 10 femmine (9 sterilizzate e 1 intera), con un'età mediana di 1 anno e 11 mesi (range, 9 mesi – 13 anni).

Circa la metà dei gatti (8/18), riceveva farmaci per un sospetto processo emolitico o immuno-mediato, inclusi doxiciclina e corticosteroidi, e un gatto aveva ricevuto una trasfusione di emazie concentrate.

La maggior parte dei gatti presentava anemia rigenerativa e trombocitopenia. Altri reperti comuni includevano iperglobulinemia e iperbilirubinemia. Molti gatti mostravano segni di anisocitosi e presenza di “ghost cell” allo striscio ematico. La maggior parte dei gatti, 12/17 (70%), ha mostrato un test di agglutinazione (saline agglutination test, SAT) positivo, suggestivo di IMHA. Nessun gatto era positivo ai test per micoplasmi emototropi.

La diagnosi principale è stata quella di IMHA in 12/18 (66%) gatti e precursor‐targeted immune‐mediated anemia (PIMA) in 6/18 (33%).

I gatti sono stati testati contemporaneamente per la FIV e sono risultati tutti negativi.

La PCR per provirus FeLV è stata eseguita in tutti i gatti, con esito negativo. In 9 (50%) gatti, è stato eseguito un secondo test antigenico FeLV dopo la remissione dei segni clinici e la normalizzazione della conta dei globuli rossi. Tutti i test antigenici di follow-up hanno mostrato dei risultati negativi. Il tempo mediano per l'esecuzione del secondo test è stato di 42 giorni dopo la diagnosi (range, 17 - 159 giorni).

Un gatto è stato sottoposto al test antigenico in modo seriale per valutare quando il paziente sarebbe diventato sieronegativo. Nonostante il test ELISA sia un test qualitativo, i risultati positivi erano meno chiari dopo l'inizio del trattamento immunosoppressivo e dopo 1 mese il test era diventato negativo.

Infine, 2 gatti che avevano avuto risultati negativi al test ELISA durante il follow-up hanno mostrato una recidiva di IMHA dopo 6 e 9 mesi dalla prima diagnosi, e il test ELISA FeLV è risultato nuovamente positivo.

La figura rappresenta in modo schematico i risultati dei test LFI/ELISA FeLV e PCR provirus FeLV in entrambi gli studi.

Questi due studi mostrano la complessità nell’interpretare i risultati dei test diagnostici per la FeLV nei gatti con malattie ematologiche, a causa della possibilità di avere risultati discordanti tra i test sierologici e molecolari.

Gli autori di entrambi gli studi discutono che, nonostante la positività ai test sierologici per l'antigene della FeLV, alcuni gatti non mostrano segni tipici di un'infezione attiva. Da ciò nasce il sospetto che i risultati positivi possano essere influenzati da altri fattori ed essere quindi in realtà dei FALSI POSITIVI.

Gli autori discutono le possibili spiegazioni per i risultati discordanti dei test per la FeLV e provano a dare diverse spiegazioni, tra cui:

• Reazione crociata tra una molecola sconosciuta e il test point-of-care.

Gli autori ipotizzano lo sviluppo di una reazione crociata tra gli anticorpi presenti nel siero felino e gli anticorpi anti-p27 utilizzati nel test antigenici su siero. Questa teoria si basa sul presupposto che una proteina simile a p27 possa essere coinvolta nella distruzione dei globuli rossi mediata dal sistema immunitario. Tuttavia, non è possibile escludere che l'agglutinazione dei globuli rossi abbia interferito con i risultati del test antigenico, poiché questa condizione è stata osservata in una percentuale significativa dei casi testati.

• Espressione endogena di p27

L'antigene p27 nei gatti con anemia emolitica immunomediata potrebbe derivare dai retrovirus endogeni presenti nel DNA dei gatti, che possono essere attivati e produrre proteine virali. Questo potrebbe causare risultati falsi positivi nei test per la FeLV. Tuttavia, questa ipotesi richiede ulteriori conferme.

• Interazione del tipo di campione

La scelta del campione (siero, plasma, sangue intero) può influenzare i risultati del test antigenico. È consigliabile utilizzare siero o plasma, poiché si suppone che il sangue intero possa determinare un aumento del numero di risultati falsi positivi, soprattutto se il campione è emolitico.

• Risultati falsi negativi alla PCR provirus

Ipotesi poco probabile, visti i risultati negativi del test antigenico FeLV durante il follow-up.

• Antigenemia durante la viremia primaria

I risultati potrebbero essere spiegati dal rilevamento precoce della proteina p27 durante la fase iniziale di viremia primaria. Sebbene p27 sia una proteina strutturale del virus, la sua presenza nel sangue è di solito trascurabile durante questa fase.

• Presentazione atipica della FeLV

La diagnosi di infezione da FeLV atipica è confermata dal rilevamento del provirus nel tessuto infetto. Tuttavia, le infezioni focali o atipiche da FeLV sono rare e classicamente non si associano a segni clinici sistemici e non mostrano risposta alla terapia immunosoppressiva.

Nelle conclusioni, gli autori sottolineano l'importanza di confermare i risultati positivi dei test LFI/ELISA FeLV tramite metodi molecolari come la PCR per provirus FeLV. Quest’ultimo aspetto è cruciale per evitare diagnosi errate e orientare il protocollo diagnostico e terapeutico in modo corretto, specialmente nei gatti con sospette malattie di origine immunomediata.

Bibliografia:

Kornya, M., Bienzle, D., Beeler-Marfisi, J. “Discordant FeLV p27 immunoassay and PCR test results in 21 cats with hematologic disorders”. Journal of Feline Medicine and Surgery, 25(7), 2023.

Robert, L. I., Puig, J., Tumbarello, M., et al. “A retrospective review of cats with suspected false positive results in point-of-care feline leukemia virus tests and concurrent immune-mediated anemia”. Journal of the American Veterinary Medical Association, 261(10), 1459-1465, 2023.

Antonio Maria Tardo, Med. Vet.; Esperto in Medicina Interna di MYLAV

Walter Bertazzolo, Med. Vet. EBVS European Specialist in Veterinary Clinical Pathology (Dipl. ECVCP); Direttore Scientifico di MYLAV