Finalmente ci siamo: anche nel cane possiamo iniziare a valutare lo stato mutazionale delle neoplasie in ambito routinario: ecco quello che si può fare e a cosa può servire l'analisi mutazionale del gene TP53 del cane con linfoma DLBCL.

DLBCL– Il linfoma più frequente nel cane

Tra le malattie linfo-proliferative del cane, il DLBCL è l’istotipo più frequente e rappresenta circa il 70% di tutti i linfomi in questa specie.

Il DLBCL mostra un comportamento biologico piuttosto aggressivo e si presenta prevalentemente in forma nodale multicentrica, con il coinvolgimento multiplo di organi linfatici secondari. Negli stadi clinici più avanzati si osserva anche l’infiltrazione di organi target, quali fegato, milza, midollo osseo e sangue periferico.

Secondo i criteri della classificazione dei linfomi del cane, redatti dalla World Health Organization (WHO), il DLBCL nodale è caratterizzato dalla crescita incontrollata e diffusa di una popolazione cellulare neoplastica nel contesto del linfonodo, con una compromissione totale dell’anatomia normale dell’organo.

Le cellule neoplastiche sono di dimensioni medio/grandi e molto spesso presentano nucleoli multipli periferici o nucleolo singolo centrale. Tale popolazione è riconducibile a centroblasti ed immunoblasti (FIG 1). I linfociti neoplastici sono ad immunofenotipo B e vengono identificati attraverso un esame immunoistochimico con la positività agli anticorpi CD20, CD79 o PAX5 (FIG 1). Infine, la terapia di prima linea prevede un regime chemioterapico CHOP (Ciclofosfamide, Doxorubicina, Vincristina, Prednisone) con l’eventuale aggiunta del vaccino APAVAC nel protocollo chemio-immunoterapico.

Figura 1. Classico quadro microscopico/citologico di DLBCL nel cane. Si rileva una popolazione predominante di elementi linfoidi di medie/ampie dimensioni con nucleoli ben visibili e citoplasma molto basofilo.

Figura 2. Esame istologico ed immunoistochimico di DLBCL del cane. Il linfonodo appare diffusamente infiltrato dalla popolazione neoplastica che sovverte la nomale architettura dell'organo (immagine a sinistra). Le cellule neoplastiche appaiono positive per CD20 (marker dei linfociti B) all'esame immuno-istochimico (immagine a destra).

DLBCL – La Classificazione Clinico-Patologica

Il DLBCL è stato storicamente incluso tra i linfomi “ad alto grado” o “aggressivi”, ma negli ultimi anni le ricerche in oncologia veterinaria hanno evidenziato nuovi target ed approcci terapeutici, che hanno permesso di migliorare la sopravvivenza e il tempo libero da malattia nei cani affetti da questo tumore.

Purtroppo, però, la risposta alla terapia risulta ancora molto variabile e scarsamente prevedibile alla diagnosi. Alcuni cani rimangono in remissione clinica solo per pochi mesi dopo il trattamento, altri hanno invece tempi di remissione e sopravvivenza molto più lunghi, in alcuni casi anche alcuni anni.

Questo diverso comportamento biologico in parte è giustificato da alcune variabili cliniche misurabili, come lo stadio, il sotto-stadio clinico e l’infiltrazione neoplastica del midollo osseo tramite esame di citofluorimetria a flusso. Sebbene molto utili, questi parametri non permettono di discriminare sempre la prognosi dell’animale, infatti, altre variabili potrebbero entrare in gioco rispetto alla risposta alla terapia, come il ruolo del sistema immunitario nella risposta alla terapia e il profilo genetico o molecolare del tumore stesso.

DLBCL – La Classificazione genetica, ci siamo!!

È quindi chiaro che la sola classificazione clinico-patologica non possa più essere sufficiente per caratterizzare clinicamente il DLBCL del cane. Proprio per questo motivo, in modo sovrapponibile alla medicina umana, gli studi sul DLBCL canino, negli ultimi anni, si sono concentrati principalmente per spiegare i meccanismi molecolari e genetici alla base dello sviluppo e della progressione della malattia.

Sono state identificate diverse aberrazioni nei geni coinvolti nei meccanismi di attivazione, differenziazione e proliferazione cellulare. In alcuni casi sono state scoperte mutazioni a livello del DNA che potenzialmente rendono le cellule linfoidi capaci di proliferare più rapidamente, sfuggire al controllo immunitario ed essere refrattarie alla morte cellulare programmata (apoptosi). In alcuni casi tali mutazioni sono state correlate alle variabili cliniche e alla risposta alla terapia.

Uno studio nel 2022 (Giannuzzi et al., 2022) ha infatti dimostrato come le mutazioni del gene TP53 siano un fattore prognostico negativo e indipendente nel DLBCL del cane.

Proprio per il suo ruolo, il TP53 è stato definito recentemente come "il guardiano del genoma", riferendosi alla sua capacita di riparazione del DNA danneggiato inducendo l'arresto della crescita cellulare, l'apoptosi e la senescenza cellulare. Quindi, è facilmente intuibile come in un contesto neoplastico o pre-neoplastico, eventuali mutazioni a carico di questo gene possano sopprimere tale attività favorendo la cancerogenesi.

DLBCL – Analisi del TP53 in cani con DLBCL, ecco come devo fare!!

Nei cani in cui ci sia il sospetto di una forma di DLBCL, sulla base dell’esame citologico e citofluorimetrico di un linfonodo aumentato di volume, sarà sempre necessario svolgere esame istologico ed immunoistochimico (CD3, CD20) del linfonodo escisso per intero per una conferma definitiva.

Sarà importante, nel momento in cui viene effettuata la linfoadenectomia, isolare un piccolo frammento di tessuto neoplastico (0.5 cm³ – dimensioni di un "tic tac") e conservarlo in una provetta con soluzione fisiologica al fine di svolgere l’esame della mutazione del geneTP53 (FIG 2).

La provetta deve essere inviata al laboratorio in 24-48 ore per procedere all’esame. Contestualmente, è sempre necessario inviare una aliquota di sangue in provetta EDTA (FIG 3).

Figura 3. Per l'esame mutazionale è necessario inviare a Mylav sia la biopsia linfonodale in fisiologica che il sangue periferico del paziente con DLBCL confermato da istologia ed immuno-istochimica.

Quindi, sulla base dei risultati ottenuti dalla stadiazione clinica, l’esame istopatologico / immunoistochimico, e lo screening del TP53, sarà possibile consultare l’algoritmo prognostico realizzato sulla base dello studio di Giannuzzi et al (vai sulla tua area riservata del nostro sito Mylav).

Tramite questo algoritmo si potrà identificare anche la terapia migliore in base alle variabili cliniche selezionate.

Bibliografia

Diana Giannuzzi , Laura Marconato , Antonella Fanelli , Luca Licenziato , Raffaella De Maria, Andrea Rinaldi, Luca Rotta , Nicole Rouquet, Giovanni Birolo , Piero Fariselli, Afua A. Mensah, Francesco Bertoni  and Luca Aresu. (2022) The genomic landscape of canine diffuse large B-cell lymphoma identifies distinct subtypes with clinical and therapeutic implications. Lab Animals 51: 191-202.

Luca Aresu, Università degli Studi di Torino, Responsabile del servizio di Patologia di Mylav

Walter Bertazzolo, Med. Vet. EBVS European Specialist in Veterinary Clinical Pathology (Dipl. ECVCP); Direttore Scientifico di MYLAV